YFX-CLM074
1×106cells/T25培养瓶
￥1700
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背景描述 |
PC小鼠同时携带K-Ras G12D和LSL-Trp53 R172H两种致病突变。首先将LSL-K-Ras G12D小鼠（条件性过表达K-Ras G12D突变基因小鼠）与LSL-Trp53 R172H小鼠（条件性过表达Trp53 R172H突变基因小鼠）杂交，产生基因组中携带但不表达两种致病突变基因的小鼠，即KP小鼠。然后将KP小鼠与Pdx-Cre小鼠（胰腺特异性Cre重组酶表达小鼠）杂交以产生KPC小鼠，该小鼠在Pdx启动子的调控下，通过Cre重组酶特异性删除胰腺组织中的Loxp-Stop-Loxp（LSL）基因沉默元件，使K-Ras G12D和Trp53 R172H突变基因选择性的在胰腺组织中表达。K-Ras G12D突变和Trp53 R172H突变使胰腺肿瘤发展更为迅速，同时转移潜力加大 。KPC新生小鼠胰腺正常，不存在肿瘤细胞，在8至10周龄时，胰腺内开始出现前体病变或胰腺上皮内瘤变（PanIN）；大多数小鼠在16周龄时发展出局部侵入性胰腺导管腺癌（PDAC），并伴有密集的促纤维增生反应。肿瘤通常具有中等分化的导管形态，具有广泛的间质结缔组织增生，类似于在人类肿瘤中观察到的最常见形态。此外，在约80%的KPC小鼠中体内可以观察到肿瘤的转移，主要在肝脏和肺部组织中，这些部位也是人类胰腺癌常见的转移部位。考虑到个体差异性和环境因素的影响，该模型的发病成瘤情况以实际为准。 突变情况如下：KPC: KrasG12D/G: Trp53R270H |
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细胞形态 |
上皮细胞样，贴壁生长。 |
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规格 |
>1x106 细胞数量，T25瓶或者1mL冻存管包装。 |
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细胞来源 |
小鼠胰腺。 |
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培养基 |
DMEM高糖+ 10% FBS+ 1% P/S。 |
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培养条件 |
气相：空气，95%；二氧化碳，5%； 温度：37℃；培养箱湿度为70%-80%。 |
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消化时间 |
37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间）。 |
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传代比例 |
1:2-1:5；第一次收到细胞建议T25培养瓶1：2传代。 |
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换液频率 |
2-3天。 |
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细胞冻存液 |
无血清冻存液。 |
1、收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。
2、请在4或5X显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。
3、贴壁细胞：细胞在37℃培养箱中放置2-3h，显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况，有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下，可去除培养瓶中灌液培养基（若有未贴壁的细胞需要离心回收，重悬打入到原培养瓶中）,加入新配制的完全培养基6-8mL，放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达70%-80%以上，可以对细胞进行传代处理。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。
如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：
1、在生物安全柜内，打开培养瓶瓶口，吸弃瓶内的培养基。
2、向培养瓶内加入3mL无菌的1×PBS，水平放置培养瓶，使 PBS 能够浸润到培养瓶底面上所有的面积，吸弃 PBS。
3、向瓶内加入1mL 0.25％胰蛋白酶（含EDTA），浸润底面后放入 37℃ CO2 培养箱中孵育 1~2min。
4、孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起，若全部消化下来则直接向培养瓶内加入2mL 完全培养基中，将悬液吸入15mL离心管。
注：如细胞不能一次性完全消化，可采取如下方法：
A. 准备一个无菌的 15mL离心管，加入 2mL完全培养基。
B. 将消化下来的细胞加入到上述离心管中。
C. 向之前消化的培养瓶中加入 1mL 胰酶继续消化2min左右，轻拍培养瓶，95%左右细胞脱落后加入2mL含 10%FBS 的完全培养基中和，中和后的细胞悬液移入A中的离心管内。
收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。下面T25瓶为例；
1、选择指数生长期的细胞，吸去培养液，加PBS清洗1-2遍。去PBS，加入0.25% 胰酶1.5mL润洗10秒，去胰酶。将培养瓶放37度培养箱，靠残余胰酶继续消化细胞直至细胞变圆，拍打瓶侧使细胞脱落。细胞消化下来后，加5mL培养液全部吹打下来，再1000RPM离心3分钟。
2、加入1-1.5mL成品冻存液，分装至2mL冻存管里，将冻存管放入充满异丙醇的程序降温盒中，之后转入-80℃度冰箱过夜，第二天再转至液氮。
1、将恒温水浴锅中的水预热到37℃。
2、准备一支15mL 离心管，加入5mL 完全培养基，放入 37℃水浴锅中预热。
3、戴上护目镜，厚毛线手套后，从液氮罐中取出要复苏的细胞，尽快转入 37℃恒温水浴锅中复温晃动冻存管以提高复温速率。
4、将融化了的冻存管中的细胞吸入事先准备的离心管中，混匀后，1000rpm 离心 5min。
5、准备一个 T-25 培养瓶，写上细胞名称、日期，再加入 4mL 完全培养基。
6、离心完成后弃去上清，用 1mL 完全培养基重悬细胞后，转入 T-25 细胞培养中，混匀后转入CO2 培养箱中培养静置。
1、所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。
2、建议在复苏冻存细胞时始终使用防护手套、衣服和戴上防护面罩。注意：冻存管浸没在液氮中会泄漏，并会慢慢充满液氮。解冻时，液氮转化成气相可能导致容器爆炸或用危险力吹掉其盖子，从而产生飞扬的碎屑造成人员伤害。
