改良型NAD+/NADH含量检测试剂盒 (WST-8 法)

产品简介

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)作为辅酶参与到很多酶催化的氧化还原反应中，存在氧化型(NAD+)和还原型(NADH)两种形式。NAD+/NADH检测试剂盒(WST-8法)无需从样品中纯化NAD+/NADH，基于 WST-8的显色反应，通过比色法检测细胞、组织或其他样品中氧化型辅酶|(NAD+)和还原型辅酶 (NADH)各自的含量、比值及总含量的试剂盒。

检测原理如下

检测氧化型辅酶|(NAD+)和还原型辅酶(NADH)总量:乙醇(Ethano)在乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase, ADH)的作用下氧化生成乙醛(Acetaldehyde)，这一反应过程中氧化型辅酶(NAD+)被还原成还原型辅酶(NADH)，生成的NADH在电子载体存在下将WST-8 还原成检黄色的甲臜(Formazam), 在450 nm 处有最大吸收峰，体系中生成甲臜的量与NAD+/NADH总量呈线性关系。

检测还原型辅酶(NADH)含量: NAD+在给定的缓冲体系中不稳定，样本经过60°C加热30 min预处理后，体系中的氧化型辅酶(NAD+)分解，只保留还原型辅酶(NADH)，还原型辅酶(NADH)将WST-8还原成橙黄色的甲臜，通过比色法确定甲臜生成量来确定样品中还原型辅酶(NADH)含量。

检测氧化型辅酶(NAD+)含量：根据上述NAD+/NADH总量及还原型辅酶(NADH)的量，二者差值即为氧化型辅酶(NAD+)含量。据此计算出氧化型辅酶(NAD+)与还原型辅酶(NADH)比值。

试剂盒组成

样本处理方式

1、组织：用预冷的PBS清洗组织后，取10-30mg组织样品，用剪刀剪碎置于匀浆器中，加入预冷的400µL NAD+/NADH提取液，冰上匀浆。

2、贴壁细胞：取1×106个细胞（6孔板单孔长满细胞数量），尽可能吸除培养液，加入预冷的200µL NAD+/NADH提取液，冰上轻轻吹打使细胞裂解。

3、悬浮细胞：取1×106个细胞，600g 离心5min，尽可能吸除培养液，加入预冷的200µL NAD+/NADH提取液，冰上轻轻吹打使细胞裂解。

4、裂解过程10min左右，4°C  12000g离心5-10min，取上清即为待测样品。

注意事项

1、 使用前，将冻存的各组分充分融解并轻轻混匀后再使用。

2、 NADH配制成溶液后，建议分装后-80°C保存。NADH不稳定，如果发现标准曲线不理想，有可能是标准品发生了降解，此时建议用新的NADH粉末重新配置标准液。

3、 NAD+/NADH提取缓冲液比较粘稠，稀释过程中务必保证稀释均匀，否则易造成实验数据波动。在检测过程中，应尽量避免产生气泡，以免影响最终的吸光度测定。

4、 建议每次检测都重新绘制标准取曲线。

5、 NAD+和NADH不稳定，样品在冻存过程中较易降解，建议使用新鲜样品进行检测。

6、 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。

7、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。