改良型NADP+/NADPH含量检测试剂盒 (WST-8 法)

产品简介

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADP) 作为辅酶参与到很多氧化还原反应中，存在氧化型 (NADP+ ) 和还原型 (NADPH) 两种形式。 

翼飞雪NADP+ /NADPH 检测试剂盒（WST-8 法）是无需从样品中纯化 NADP+ /NADPH，基于 WST-8 的显色反应，通过比色法检测细胞、组织或其他样品中氧化型辅酶 Ⅱ (NADP+ ) 和还原型辅酶 Ⅱ (NADPH) 各自的含量、比值及总含量的试剂盒。

检测原理如下 

1、检测氧化型辅酶 (NADP+ ) 和还原型辅酶 (NADPH) 总量：葡萄糖-6-磷酸(glucose 6-phosphate, G6P)在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose 6-phosphate dehydrogenase,G6PDH)的作用下氧化生成6-磷酸葡萄糖内脂(6·phosphogluconate,6-PG)，这一反应过程中氧化型辅酶(NADP+)被还原成还原型辅酶(NADPH)，生成的NADPH在电子载体存在下将 WST-8 还原成检黄色的甲臜(Formazam), 在450 nm 处有最大吸收峰，体系中生成甲臜的量与NADP+/NADPH总量呈线性关系。

2、检测还原型辅酶 (NADPH) 含量：NADP+在给定的缓冲体系中不稳定，样本经过60°C加热30 min预处理后，体系中的氧化型辅酶(NADP+)分解，只保留还原型辅酶(NADPH)，还原型辅酶(NADPH)将WST-8还原成橙黄色的甲臜，通过比色法确定甲臜生成量来确定样品中还原型辅酶(NADPH)含量。

3、检测氧化型辅酶 (NADP+ ) 的含量：根据上述NADP+/NADPH总量及还原型辅酶(NADPH)的量，二者差值即为氧化型辅酶(NADP+)含量。据此计算出氧化型辅酶(NADP+)与还原型辅酶(NADPH)比值。

试剂盒组成

样本处理方式

1、组织：用预冷的PBS清洗组织，取10-30mg组织样品，用剪刀剪碎置于匀浆器中，加入预冷的400µL NADP+/NADPH提取液，冰上匀浆。

2、贴壁细胞：取1×106个细胞（6孔板单孔长满细胞数量），吸净培养液，加入预冷的200µL NADP+/NADPH提取液，冰上轻轻吹打使细胞裂解。

3、悬浮细胞：取1×106个细胞，600g 离心5min，吸净培养液，加入预冷的200µL NADP+/NADPH提取液，冰上轻轻吹打使细胞裂解。

4、裂解10min左右之后，4℃ 12000g离心10min，取上清待测。

注意事项

1、 使用前，将冻存的各组分充分融解并轻轻混匀后再使用。

2、 NADPH配制成溶液后，建议分装后-80°C保存。NADPH不稳定，如果发现标准曲线不理想，有可能是标准品发生了降解，此时建议用新的NADPH粉末重新配置标准液。

3、 NADP+/NADPH提取缓冲液比较粘稠，稀释过程中务必保证稀释均匀，否则易造成实验数据波动。在检测过程中，应尽量避免产生气泡，以免影响最终的吸光度测定。

4、 建议每次检测都重新绘制标准取曲线。

5、 NADP+和NADPH不稳定，样品在冻存过程中较易降解，建议使用新鲜样品进行检测。

6、 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。

7、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。