辅酶ⅠNAD(H)含量检测试剂盒

产品简介

辅酶ⅠNAD(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循环（TCA）的主要氢受体，生成的 NADH 经呼吸电子链（ETC）传递把电子交给氧，在合成 ATP 的同时，形成大量的 ROS，同时 NADH 再生为 NAD+。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和 NADH/NAD+比值的高低可用于评价糖酵解和 TCA 循环的强弱。 较高的 NAD(H)及 NADH/NAD+比值说明细胞呼吸耗氧量较高，处于过氧化状态。此外，NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和 TCA 循环。另外，NAD+降解产物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。 

本试剂盒分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NAD+和 NADH，NADH 通过 PMS 的递氢作用，还原氧化型噻唑蓝（MTT）为甲瓒，在 570nm 下检测吸光值；而 NAD+可被乙醇脱氢酶还原为 NADH，进一步采用 MTT 还原法检测。

试剂盒组成

样本处理方式

1、组织中NAD+和NADH的提取

NAD+的提取：按照组织质量（g）：酸性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约 0.1g 组织，加入 1mL 酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃ 离心 10min，取上清，置冰上待测。

NADH的提取：按照组织质量（g）：碱性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约 0.1g 组织，加入 1mL 碱性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、细胞/细菌中NAD+和NADH的提取

NAD+的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（104 个）：酸性 提取液体积（mL）为500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 酸性提取液）， 超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

NADH的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（104 个）：碱性提取液体积（mL）为500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 碱性提取液），超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

3、血清/血浆中NAD+和NADH的提取

NAD+的提取：按照血清（浆）体积（mL）：酸性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建 议取约 0.1mL 血清（浆），加入1mL 酸性提取液），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 

NADH的提取：按照血清（浆）体积（mL）：碱性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约 0.1mL 血清（浆），加入1mL 碱性提取液），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）； 冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中 和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

注意事项

1、 如果一次性测定样本数较多，可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。

2、 对照管和测定管的测定步骤的区别：对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六；测定管加完试剂一、二、三、四和五后必须反应 20min 后再加试剂六。

3、 若 NAD+测定中△A（A2-A1）≤0.0302，NADH 测定中△A（A2-A1）≤0.0222，已低于检测限，可做如下调整：（1）将测定管避光静置时间 20min 延长到 60min；（2）在提取阶段增加取样量，即取 0.2g 样本或 0.2mL 样本加入 1mL 提取液。

4、 最低检测限为 0.1nmoL/mL 或 0.1nmoL/g 鲜重 或 0.001nmoL/mg prot。

5、 由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒100管保证测48个NAD+或 NADH。

6、 操作过程需注意避光。