活性氧（ROS）检测试剂盒

产品简介

翼飞雪活性氧检测试剂盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit，也称 ROS Assay Kit）是一种利用荧光探针 DCFH-DA 进行活性氧检测的试剂盒。 DCFH-DA 本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成 DCFH。而 DCFH 不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的 DCFH 生成有荧光的 DCF。检测 DCF 的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。

本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂 Rosup，以便于活性氧的检测。Rosup 是一种混合物，浓度为 50mg/mL 。

本试剂盒本底低，灵敏度高，线性范围宽，使用方便。

本试剂盒可以测定 100～500 个样品。 

试剂盒组成

样本处理方式

对于刺激时间较短（通常为 2 小时之内）的细胞，先装载探针，然后用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞；对于刺激时间较长（通常为 6 小时之上）的细胞，先用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，然后装载探针。

1、 原位装载探针：本方法适用于贴壁细胞。按照 1 ∶1000 用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为 10μmol/L。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的 DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的 DCFH-DA 不少于 1ml。37℃细胞培养箱内孵育 20min。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的 DCFH-DA。通常活性氧阳性对照在刺激细胞 20～30min 后可以显著提高活性氧水平。

2、 收集细胞后装载探针：按照 1 ∶1000 用无血清培养液稀释 DCFH-DA，使终浓度为 10μmol/L。细胞收集后悬浮于稀释好的 DCFH-DA 中，细胞浓度为一百万至二千万/mL，37℃细胞培养箱内孵育 20min。每隔 3 ～5min 颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的 DCFH-DA。直接用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，或把细胞等分成若干份后刺激细胞。

实验案例

1、检测

对于原位装载探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。对于收集细胞后装载探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，也可以用激光共聚焦显微镜直接观察。

2、参数设置

使用 488nm 激发波长，525nm 发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF 的荧光光谱和 FITC 非常相似，可以用 FITC 的参数设置检测 DCF。DCF 的激发光谱和发射光谱参考下图。

3、其他说明

阳性对照可以按照 1 ∶1000 的比例使用。例如装载好探针的细胞共 1ml，可以加入 1μl的阳性对照刺激。通常刺激后 20～30min 内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后 30min 内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照的浓度。

另外，对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照 1 ∶2000～1∶5000 稀释 DCFH-DA，使装载探针时 DCFH-DA 的浓度为 2～5μmol/L。探针装载的时间也可以根据情况在 15～60min 内适当进行调整。

活性氧阳性对照（Rosup）仅仅用于作为阳性对照的样品，并不是在每个样品中都需加入活性氧阳性对照。

注意事项

1. 探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

2. 探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。DCF 的激发光谱和发射光谱请参考上图。

3. 尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。

4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

应用文献

※  IF=10.6. Zhanyang Qian，Mingjie Xia，Tianyu Zhao，et al. ACOD1, rather than itaconate, facilitates p62-mediated activation of Nrf2 in microglia post spinal cord contusion. Clin. Transl. Med，  2024;14:e1661.

※ IF=9.8： Zi-Yue Yang，Hai Liu，Jing-Ya Li，et al.  Road dust exposure and human corneal damage in a plateau high geological background provincial capital city: Spatial distribution, sources, bioaccessibility, and cytotoxicity of dust heavy metals. Science of the Total Environment，912 (2024) 169140.