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荧光定量PCR常见问题

发布时间:2017-11-29 浏览次数:4170



Q1:荧光信号升高太高,杂乱无章,看上去像扩增失败,超出检测范围?

 

A1:该现象主要表现在ABI仪器系列,原因主要是ROX浓度较低,对于ABI系列,除ABI 7500ABI 7500FAST之外,ABI系列仪器应都使用高浓度ROX染料。



Q2:高浓度模板,Ct值却更低,甚至检测不到?

 

A2:该现象是因为模板含量太高,信号出现早,与仪器基线设置不匹配的原因。可通过A:稀释模板; B: 修改数据分析时的基线设置,使基线的循环数小于小于样品的Ct值。

 

Q3:阴性对照有扩增,但多个阴性对照的Ct值大小不等,熔解曲线呈单峰。


A3:反应体系被污染。具体有3个可能:

A3-1:模板交叉污染:需要使用带滤芯的吸头;

A3-2PCR产物气溶胶污染:反应体系中加入UNG/dUTP(会增加实验成本); 将反应体系的准备与产物跑胶在不同场所进行。

A3-3:反应体系下的其它组分被污染:换用新的组分。

 

Q4:阴性对照有扩增,多个阴性对照的Ct值类似,熔解曲线有多个峰

 

A4:有引物二聚体。可通过如下方法解决:

A4-1:降低引物浓度至0.1μM

A4-2:将PCR扩增程序由两步法改为三步法。

A4-3:重新设计引物。

 

Q5:熔解曲线有2个或者2个以上的峰

 

A5:反应特异性差;有引物二聚体或者其他非特异性扩增。可通过如下方法解决:

A5-1:降低引物浓度至0.1μM

A5-2:将PCR扩增程序由两步法改为三步法。

A5-3:重新设计引物。


Q6ΔRn⠼font face="宋体" >不超过1,在低水平徘徊

 

A6-1⠼font face="宋体" >无扩增:无模板的阴性结果、引物问题、组分加错等原因。

A6-2: 样品中模板含量太高:稀释模板

A6-3CT值出现太早:修改数据分析时的基线设置,使基线的循环数小于样品的CT值。

A6-4: 与仪器设置不匹配。

 

Q7:标准曲线斜率绝对值大于4,扩增效率低于90%

 

A7-1:模板中含有PCR反应抑制因子,反应被抑制:将模板进行稀释,或者重新提取RNA,或者 春花cDNA

A7-2:难扩增模板:PCR扩增阶段采用三步法,延长延伸时间,调整镁离子浓度等。

A7-3:引物问题:换用其它引物进行PCR反应,如其它引物无此问题,则说明是引物问题。改变扩增条件可能有改善,如仍无改善,需要重新设计引物。

A7-4:模板稀释错误:重新稀释模板。

 

Q8:标准曲线斜率绝对值小于3,扩增高于110%

A8-1:非特异性扩增:降低引物浓度;改变退火温度;重新设计引物。

A8-2:引物二聚体:降低引物浓度,重新设计引物。

A803: 模板稀释错误:重新稀释模板。

 

Q9:标准曲线R2小于0.98

A9-1:标准曲线的个别点结果有误:检查CT值的最大点和最小点是否超过检测范围,只有在线性范围内定量才是准确的。

A9-2:模板稀释错误:重新稀释模板。


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