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核酸提取纯化常见问题

发布时间:2016-9-4 浏览次数:3284

A. 使用翼飞雪任何产品,都需要严格按照翼飞雪产品说明书进行操作。

B. DNA/RNA/蛋白提取,产物量(观察现象)与产物纯度始终是一对矛盾。

C. 提取之前,先仔细阅读说明书,重点查阅说明书中黑体加粗的提示。


Q1提取质粒加入B uffer 3之后,提高离心速度和离心时间,对于提取产物有何影响?

A1加入Buffer 3之后提高立新速度和离心时间确实有利于沉淀贴壁更加紧密,但是常温

下离心时间过长会使液体温度升高,造成质粒降解。一般情况下可以412000rpm离心

10min,或者常温下12000rpm离心3-4min即可。

 

Q2琼脂糖凝胶回收时,如回收DNA片段过短怎么样处理?

A2: 如果回收DNA片段小于500bp时,为了提高回收效率,可以在加入凝胶液溶解凝胶

后,加入1.5倍体积凝胶块体积的异丙醇,并充分颠倒混匀。

 

Q3: 琼脂糖凝胶回收时,如何处理凝胶液溶胶后的颜色异常?

A3: 凝胶液完全溶胶后,正常颜色应该是浅黄色。如果颜色变为红色或者橙色之后,需要加入5μl 5M NaAcpH5.2)调节溶液的pH值,是混合物的颜色恢复为正常的浅黄色(如不调节pH值,会影响DNA的回收率)。

 

Q4: 基因组DNA提取的时候,如何确定裂解液体积与样品质量的关系:

A4理论上,裂解液的体积越大、样品的量越少,提取产物的质量越好。因此裂解液体积与样品质量的最佳比例应在实验前摸索优化。如下仅为1ml裂解液能够裂解样品量的推荐数值,仅供参考。

动物组织:5-10mg

贴壁细胞:10cm2

悬浮细胞:5× 106数量

人血液:100-300 μl

小鼠血液:50-100 μl

植物组织:30mg

土壤:300mg

粪便:10mg

革兰氏阴性菌:1ml

酵母、革兰氏阳性菌、丝状真菌:10mg

复杂样品(食品、垃圾、植物器官、多糖多酚植物):300mg

 

Q5: 基因组DNA提取时,采取哪些方法可以提高产物得率?

A5-1适当加大裂解液体积与样品质量的比例。

A5-2洗脱液提前预热至65 左右,同时洗脱液上柱时要小心加到吸附膜的中间部位,并确保液体将膜全部覆盖。

A5-3: 样本裂解后的混合液上柱时如体积过大,需要分次上柱,并且确保每次上样量不超过700μl

A5-4适当延长组织的匀浆和裂解时间。

 

Q6提取产物的A260/A280比值较高的原因?

A6纯净的DNAA260/A280比率在1.8-2.0之间,如样品中RNA的残留量较多,则会造成A260/A280的比较较高,需要在提取过程中加入RNase A(如提取过程中按照说明书加入了RNase A,则要考虑RNase活性降低的可能性)。

 

Q7: 血液基因组DNA提取之前的样本处理注意事项?

A7-1: 人血液中含有大量可能干扰下游DNA分析的酶抑制剂,另外诸如干扰素、EDTA等通用的抗凝剂还会干扰下游检测。因此从人血液中分离DNA时,需要具备可提供不含污染物和酶抑制剂的优质DNA的方法。

A7-2 哺乳动物的红细胞中不含有核酸,但健康的哺乳动物血液中红细胞含量要超过含有核酸的白细胞(包括淋巴细胞、单核白细胞、颗粒性白细胞等)近1000倍,因此在提取基因组DNA之前去除红细胞可提高DNA产量,推荐方法如下:

A7-2-1选择性溶解红细胞:在低渗缓冲液条件下,红细胞会较早低渗休克和快速破裂。

A7-2-2Ficoll密度梯度离心法,可回收单核细胞(淋巴细胞和单核细胞)并去除红细胞(此方法还可去除粒细胞)。

A7-2-3室温下对全血进行3300g离心10min,离心后会分成三层:上清层为质粒;中间层为白细胞层;底层含有浓缩的红细胞。

A7-3鸟类、鱼、青蛙的红细胞含有核酸,因此不需要处理红细胞。

A7-4: 血液样本(包括经过红细胞去除处理的血液样本),可采用裂解液和蛋白酶或蛋白酶K有效裂解。

A7-5除动物基因组DNA外,也可以从血液中分离病毒和细菌DNA

 

Q8RNA提取的时候,如何确定裂解液和样本量的关系?

A8: 理论上,裂解液的体积越大、样品的量越少,提取产物的质量越好。因此裂解液体积与样品质量的最佳比例应在实验前摸索优化。如下仅为1ml裂解液能够裂解样品量的推荐数值,仅供参考。

动物组织:50-100mg

贴壁细胞:10cm2

悬浮细胞:5× 106数量

人血液:100-300 μl

小鼠血液:50-100 μl

植物组织:50mg

土壤:300mg

粪便:10mg

革兰氏阴性菌:1ml

酵母、革兰氏阳性菌、丝状真菌:10mg

复杂样品(食品、垃圾、植物器官、多糖多酚植物)200mg

 

Q9RNA提取时样本的处理方式?

A9-1理论上越新鲜的样本,提取的总RNA质量越好。如果不能及时提取,需要使用液氮迅速冷冻样本,然后一直储存于-80条件下。 样本的反复冻融对于提取RNA的质量有很大的影响。

A9-2破碎:组织结构、细胞壁和细胞质膜的彻底破碎对于释放样本中所有的RNA是绝对必要的。不同的样本需要使用不同的方法以达到彻底的破碎效果。不完全的破碎会导致RNA得率的显著降低。  

A9-3匀浆:匀浆对于减少破碎后细胞裂解产物的粘性是十分必要的。匀浆能切断高分子量的基因组DNA以及其它高分子量的细胞组分,得到均匀的裂解产物。匀浆不彻底会导致RNA结合效率的下降而显著降低得率。

A9-4不同样本处理方法建议

样本来源

破碎方法

匀浆方法

建议

动物培养细胞

加入裂解缓冲液

使用转子-定子匀浆机或注射器和针头获取胞质RNA

如细胞数量少于1×105,可使用涡动匀浆裂解产物,不建议匀浆方案。

动物组织

转子-定子匀浆机

转子-定子匀浆机

同步进行破碎和匀浆

研钵和

注射器和针头

使用转子-定子匀浆机和玻珠研磨机通常比使用研钵和的得率更高。

玻珠研磨机

玻珠研磨机

 

细菌

加入裂解缓冲液

涡旋机

如果处理大于5×108个细胞,使用注射器和针头进行匀浆可能会提高产率。

玻珠研磨机

玻珠研磨机

不能使用涡动操作代替。

酵母

酶解(溶菌酶/消解酶)细胞壁后加入裂解缓冲液

涡旋机

 

玻珠研磨机

玻珠研磨机

不能使用涡动操作代替。

植物和丝状真菌

研钵和

注射器和针头

研钵和不能代替转子-定子匀浆机。

 

Q10RNA提取后如何定量?

A10-1检测RNA样本时,需确保比色杯中去除了RNA酶,特别是测定之后仍需回收这些RNA的情况下(操作方法可按照通过使用0.1M NaOH1mM EDTA和不含RNase水的顺序来依次洗涤)。

A10-2使用紫外通透塑料比色杯的分光光度计时,测量A260的吸光值时,读数应该在0.15-1.0之间,A260波长下,1个单位的吸光值对应44μg/mlRNA浓度(这一相关性仅对中性pH值条件下的检测有效。因此如需稀释RNA样品,应使用如pH7.010mM Tris HCl的中性pH值的低盐缓冲液。)

A10-3RNA定量举例

RNA样品体积=100μl

稀释=10μl RNA样品+490μl 10mM Tris HClpH7.0(稀释倍数1:50

使用1mlRNA酶的比色杯,检测稀释后样本的吸光度

A260=0.2

 

RNA浓度

=44μg/ml × A260 × 稀释倍数

= 44μg/ml × 0.2× 50

=440μg/ml 


Q11提取产物低

A11-1:没有使用平衡液平衡柱膜。

 

A11-2:样品裂解不充分:

-样品与裂解液必需充分混匀

-增加裂解液:样品的体积质量比

-动物组织处理前切成尽量小的小块

 

A11-3:样品质量不好

-样品尽可能新鲜(如植物组织越嫩越好)

-样品采集后如不能及时提取,需尽快-70或者液氮储存

-样品避免反复冻融

 

A11-4:离心柱堵塞

过柱前裂解液混合物应呈现清澈,如有浑浊应离心去除

 

A11-5:洗脱条件需要优化

-使用试剂盒的洗脱液进行洗脱,尽量不使用超纯水洗脱

-使用超纯水洗脱,必需调节值pH7.0-8.5

-洗脱液提前在65温浴1-2min,对提高DNA产量极有帮助

-洗脱液要添加在柱膜中央,且全部覆盖柱膜

 

A11-6:部分样品需要添加蛋白酶K(如鼠尾组织)

-试剂盒中没有此成分,如大客户需要,可以赠送(使用方法与使用量参考其他公司)


Q12:DNA影响后续酶切反应

A12:洗脱液YWS(Wash Solution)中的乙醇有残留

   -加入YWS离心后,再次离心的步骤切不可省略。

 

Q13:DNA降解

A13:-样本不新鲜

   -液氮研磨时有回潮现象

 

Q14:提取基因组DNA产物A260/A280的值较高(正常比值为1.8-2.0

A14:提取产物中RNA含量较高

   -提取过程中加入RNase A,如大客户需要,可以赠送(使用方法与使用量参考其他公司)

 

Q15:使用质粒小提试剂盒时,加入YS3缓冲液之后,提高离心速度和离心时间之后,对于提取产物有什么影响?

A15-加入YS3之后提高离心速度和离心时间,会有助于沉淀贴壁更为紧密,但常温下离心时间过长会导致液体温度升高,导致质粒降解,因此一般情况下4℃、12000rpm离心10min,或者常温下12000rpm离心3-4min即可

 

Q16:琼脂糖凝胶回收时,如回收片段过短怎么处理?

A16:-任何品牌的胶回收试剂盒,对于过小或过大的DNA片段,回收效率都会降低。如回收片段过小(<500bp),可以在溶胶后加入溶胶液1.5倍体积的异丙醇,充分颠倒混匀后,进行下一步操作。

 

Q17:琼脂糖凝胶回收时,如溶胶后溶胶液的颜色出现橙色或者红色怎么处理?

A17:-凝胶液完全溶胶后,液体颜色应该是浅黄色。如果颜色变为橙色或者红色,需要加入5µl 5M NaAcpH5.2)调节溶液的pH值,使液体的颜色恢复为正常的浅黄色。

   -如不调整pH值,会对DNA的回收率有明显的影响。


 

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